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UNcle多參數高通量蛋白質穩定性分析系統

更新時間:2019-09-24

簡要描述:

遇見Uncle:一個平臺12種穩定性應用檢測$nUncle是一個檢測穩定性的一體化平臺,可通過一臺儀器實現12種不同的應用。它采用熒光,靜態光散射(SLS)和動態光散射(DLS)的檢測方法表征蛋白質穩定性(圖1)。 多種檢測方法意味著可以對同一種樣品進行多參數檢測,例如熱熔,聚集和顆粒大小。 為了得到完整的信息,需要同時采用光散射和熒光的檢測方法,即使聚集掩蓋了蛋白質顆粒的變化,熒光也可以檢

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  1. 半數變性溫度(Tm

通過內源性熒光直接檢測蛋白質的展開,確定其熔解溫度。隨著蛋白質的展開和氨基酸的重排,色氨酸和酪氨酸的熒光變化表明蛋白質的構象發生變化。內源性熒光是直接觀察蛋白質解折疊的方法之一,即使在聚集開始后也可以這樣檢測,這與基于光散射或量熱法的方法不同。這種檢測方式可以對構建體的穩定性進行排序或比較不同的配方以獲得較有利的條件。在大多數情況下,隨著蛋白質的展開,熒光強度會發生變化或峰值漂移。但這種檢測方式也有很多例外,好的方式是對數據進行分析。Uncle檢測完整的熒光光譜,以確保擁有所需的所有數據,并以您需要的所有方式進行分析。

 

Uncle通過直接測量內在熒光的展開來確定蛋白質的熔化溫度。隨著蛋白質的展開和氨基酸的重排,色氨酸和酪氨酸的熒光變化表明其構象也發生變化。固有熒光是觀察蛋白質解折疊的直接方

 

 
   

圖1:Uncle:一站式穩定性分析平臺。

 

法之一,即使在聚合開始后也可以這樣做,這與基于光散射或量熱法的方法不同。 在大多數情況下,隨著蛋白質展開,熒光強度發生變化或峰值漂移。 但也有例外的時候,好的方法是對數據進行系統性分析。Uncle測量完整的熒光光譜,以確保擁有需要的所有數據,并以您需要的方式進行分析。

 

2.聚集起始溫度(Tagg)

通過在兩個不同波長下使用SLS同時檢測小顆粒和大顆粒,了解蛋白質在熱升溫過程中如何以及何時聚集,可以對您的構建體或制劑進行排序,找到防止或延遲聚集開始的輔料。 由于蛋白質可以展開也可以聚集,因此同時檢測Tm和Tagg可以方便確定蛋白何時展開,以及導致聚集的原因。 使用不依賴顆粒大小變化的熒光方法,即使在聚集已經開始之后也可以測量Tm。

 

 

       
       
 

 圖2:兩種不同制劑配方中抗體的熱熔(A)和熱聚集(B)曲線。     

 

 

Tm和Tagg組合檢測方法:以多種制劑制備濃度為0.5mg / mL的單克隆抗體。將每種樣品9μL加載到Uni管中,并以15-95℃的熱升溫運行,升溫速率為0.3℃/分鐘。選擇熒光強度的BCM模型作為佳分析方法。

 

Tm結果:在制劑1中,抗體經歷三個不同的轉變,由軟件確定發生在57.8℃,71.5℃和88.1℃(圖2A)。因為蛋白質直到后來才展開,相同抗體在制劑2中顯示出熱穩定性的改善, 該條件下Tm為73.6℃。

 

Tagg結果:在蛋白質一次構像展開之后,266nm處的SLS(圖2B)顯示制劑1中的抗體在67℃下突然發生聚集。在大約78℃時,266nm處的信號強度達到大值并且聚集的蛋白質開始沉淀。相反,制劑2中的相同抗體在整個熱升溫過程中幾乎不顯示聚集。此結果與SLS在473nm處(未示出)檢測的結果相似。雖然蛋白質在67°C開始聚集,但在較高溫度下,Tm2和Tm3仍可通過內源熒光檢測到。

 

  1. 用SYPRO熒光染料檢測半數變性溫度

差示掃描熒光測定法(DSF)是確定熔融溫度的經典高通量方法之一。蛋白質可與外在染料如SYPRO®Orange結合使用,當它與未折疊蛋白質的疏水表面結合時,會發生熱變換。 該應用可用于蛋白質中很少或沒有色氨酸殘基的情況,或評估濃度非常低的蛋白質穩定性的情況。 與Uncle上的其他所有應用程序一樣,該軟件簡化了數據分析,以節省時間。

 

方法:用SYPRO®Orange配制1 mg / mL的人單克隆抗體。 將9μL樣品加載到Uni管中并以15℃至95℃的熱升溫運行,升溫速率為0.5℃/分鐘,激發波長為473nm。 Uncle分析軟件使用510-680nm之間的曲線下的面積來計算曲線的拐點并分析數據。

 

結果:通過軟件計算抗體在62.5℃和76.3℃下構象發生改變(圖3)。 當蛋白質折疊時,來自SYPRO®染料被緩沖液的水性環境淬滅,熒光信號的強度很低。 當蛋白質在較高溫度下展開時,隨著疏水區域的暴露,信號顯著增加,然后在變性蛋白質的解離和聚集后再次降低。

 
   

圖3:使用SYPRO®Orange熒光染料檢測抗體的熱熔解。

 

4.△G(吉布斯自由能變)

強制降解是室溫穩定性評估的既定替代品,但熱升溫方法并不總能區分相似穩定性的條件。 對于這些棘手的問題,ΔG值可提供蛋白質穩定性的定量檢測,它可在正交應力條件下測量。 通過將蛋白質暴露于化學變性劑中并測量其所產生的熒光變化,可以計算蛋白構象展開所需的能量。

 

方法:制備含2至9.2M尿素的32個點的變性曲線,其中治療性抗體的終濃度為864μg/ mL。 將樣品在室溫孵育過夜,確保反應達到平衡。取9μL樣品分別加到Unis管中,并在25℃檢測。

 

結果:圖4顯示抗體在350/330nm處的熒光比值與變性劑濃度的函數關系。蛋白質在變性劑濃度4.6M和6.3M下經歷兩種不同的構象改變。Uncle分析軟件使用3-state模型擬合數據,計算在兩種構象改變條件下的ΔG值分別為9.89kcal/mol和10.9kcal/ mol。 在室溫下反應達到平衡時,首次次構象發生改變的變性蛋白質為0.06ppm,樣品第二次發生構象改變時變性蛋白質為0.01ppm。

 

  1. 等溫穩定性

等溫穩定性是穩定性評估的另一種方法。不是將溫度升高以引起熔化轉變,而是將樣品在略低于預期Tm的溫度下保持更長時間。 將樣品密封在Uni比色管中,溫度可保持數小時或數天而不會蒸發。選擇在熒光和SLS模式下同時檢測樣品的構象展開和聚集,如果想了解分子或聚集體的大小如何隨時間變化,請選擇DLS。

 

方法:以PBS(制劑A)和增加不同濃度精氨酸的PBS溶液(制劑B-E)配制終濃度1mg/mL的人抗體。 將每種樣品9μL加載到Uni管中并在60℃下孵育36小時,該溫度低于抗體的解鏈溫度。

 

結果:圖5顯示在266nm處的光散射強度。隨著精氨酸濃度的增加,聚集減少,在更長的孵育時間里,差異的幅度更明顯。

 
   

圖4:治療性抗體的變性曲線。通過Uncle 軟件采用3-state模型計算表中的數值

 
   

圖5:在五種不同制劑配方中抗體的等溫聚集。

 

6.熱變性恢復

熱變性恢復可以檢測蛋白構象展開的可逆性,或監測溫度變化如何影響分子。選擇一個溫度(或幾個),并上下升高,觀察蛋白質是否可以在選擇的制劑中重新折疊。選擇熒光,SLS模式同時檢測蛋白構象展開,重折疊和聚集。如果想監測蛋白質的構象隨著流體動力學粒徑大小和時間的改變,可選擇收集DLS數據。

 

方法:用PBS緩沖液制備終濃度5mg/mL的人抗體。將9μL樣品加載到Uni管中,并在15°C至58°C的溫度下運行三次溫度升溫,每個溫度保持20分鐘,然后在15°C至70°C溫度下進行三次溫度升溫,每個溫度保持20分鐘。

 

結果:該圖顯示了通過在熒光信號的BCM模型下測量蛋白質的解折疊和重折疊,以及473nm處的光散射強度(圖6)。當蛋白質升溫至低于其Tm的溫度時,看到的少量構象展開是部分可逆的,并且不會導致任何聚集體形成。然而,當溫度升高至70℃時,較大的顆粒不可逆地形成,即使樣品冷卻至15℃,熒光信號仍然很高。

 

7.粒度與多分散性系數

DLS是一種高靈敏度的工具,用于測量溶液中蛋白質和小分子的流體動力學粒徑大小。 Uncle的靈敏度符合行業高標準,可以在低至0.05mg/mL的濃度下檢測蛋白質的大小。 使用DLS可以識別聚集體或雜質的存在,并確認分子是否是期望的大小。另外,可以15-95°C之間的任何溫度下獲得粒徑信息。

多分散性是樣品不均勻性的衡量標準,如果顆粒尺寸不均勻,將檢測到較高的多分散性值。 低多分散性值表明顆粒尺寸更均勻。Uncle在檢測粒徑的同時不使用任何額外的蛋白質或添加任何時間,即可獲得有關多分散性的更多信息,并可在相同樣品上進行其他實驗。

 

方法:將9μL 0.5mg/mL的單克隆抗體加載到Uni管中,并在62℃保持16小時,每10分鐘測量4次DLS數據,每次5秒。 在開始(t = 0)和結束(t = 16小時)時樣品的尺寸分布顯示在圖中(圖7)。

 

結果:在運行開始時,抗體在預期大小處有一個峰,并且多分散性值低于0.1,表明為單分散性樣品。 在62℃孵育16小時后,在該制劑的Tm或Tagg溫度以下,存在兩個不同(較大)的峰,并且多分散性已增加至高于0.5,表明聚集體有顯著的增加。

 

8.升溫粒度

確定或確認生物制劑熱穩定性的另一種方法是用DLS測量蛋白質的流體動力學粒徑大小,因為蛋白粒徑在熱應激下會經歷構象變化。通過DLS測量粒徑的增加是蛋白構象展開的證據。然而,在聚集開始后,僅用光散射不能確定真正的熔融溫度。 Uncle的多種檢測模式可更清晰地了解蛋白質構象的展開和聚集,從而可靠地監測蛋白質的構象變化。

 

方法:將9μL0.5mg/ mL的單克隆抗體加載到Uni管中,并以40-74℃的熱升溫運行,升溫速率為0.3℃/分鐘。每次檢測都進行兩次DLS信號采集,每次采集3秒。

 

結果:溫度在70℃之前,總體平均粒徑和散射光強度保持恒定;溫度在70℃左右,兩種檢測值均顯著增加(圖8)。這與該制劑中抗體的第二次構象展開相對應。

 
   

圖6:蛋白質在六輪加熱和冷卻后的熱變性恢復。

 
   

 

 

9.kD:(擴散相互作用系數)

Uncle能確定蛋白質在不同配方中的擴散相互作用系數,以幫助預測其膠體穩定性或聚集的可能性。在結構和制劑配方縮小到更小范圍后,使用這種非侵入式技術可以驗證優化后的條件。另外,只需一次實驗和幾分鐘的時間即可以同時獲得B22值。

 

方法:配制不同pH,不同緩沖液(乙酸鈉,組氨酸或磷酸鹽)終濃度15mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)。通過光吸收檢測蛋白確切的濃度,并且在每個pH條件下進行6次稀釋,直至2mg / mL。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,每個樣品三次重復。采集4次DLS數據,每次5秒。 Uncle分析軟件使用每個樣品測量的流體動力學粒徑,結合制劑信息,計算擴散系數。通過擬合直線的斜率和截距來計算kD值。

 

結果:強陽性的kD值(如該蛋白質在pH7條件下所見)表明蛋白凈排斥相互作用(圖9)。 kD值隨pH降低而降低。在pH 4時,負kD值表明蛋白之間的凈吸引相互作用。這與之前在這些條件下對BSA的檢測結果*。

 

       
       
 

10.B22:(第二維里系數)

第二維里系數是研究樣品中蛋白質分子之間相互作用的既定且有價值的方法。在測量kD的同時,使用完全相同的樣本,即可獲得獨立計算的B22測量結果,通過它幫助預測蛋白質在制劑配方中的聚集傾向。正B22值表示蛋白質分子之間的凈排斥力,而負B22值表明蛋白質易于自我結合。

 

方法:在Uni管中測量甲苯散射強度,以校準儀器的標準參數。配制不同pH,不同緩沖液(乙酸鈉,組氨酸或磷酸鹽)終濃度15mg / mL的牛血清白蛋白(BSA)。通過光吸收檢測蛋白確切的濃度,并在每個pH條件下進行6次稀釋,直至2mg / mL。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,每個樣品三次重復。采集4次DLS數據,每次5秒。 Uncle軟件使用每個樣本的光散射強度來計算Kc/R值,通過數據擬合線的斜率計算B22。

 

結果:強陽性的B22值(如在該蛋白質的pH7條件下所見)表明凈排斥相互作用,這與相同條件下獨立測量的kD值*(圖10)。同樣地,在pH4時,負B22值表明分子之間有相互吸引的作用,因此該條件不是該蛋白質的有利制劑。

 

11.G22 : (Kirkwood-Buff Integral)

G22是一種更嚴格的檢測蛋白質的凈自身相互作用參數的方法,特別是在高濃度時,G22可以確定樣品中的蛋白質-溶劑和蛋白質-溶質相互作用。與B22不同,陰性G22值表示蛋白質分子之間的凈排斥力,而陽性G22表示可能的自結合。這節省寶貴的樣本和時間,可以對B22數據重新分析,以獲得在蛋白高濃度時的G22值。

 

方法:在Uni管中測量甲苯散射強度,以校準儀器的標準參數。在pH5的40mM乙酸鈉緩沖液(含或不含300M NaCl)中制備80mg / mL的α-胰凝乳蛋白酶原。通過光吸收測量蛋白濃度,并6次稀釋蛋白至20mg / mL。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,每個樣品三次重復。采集4次DLS數據,每次5秒。Uncle軟件使用每個樣品的光散射強度來計算R90/K值,其與蛋白質的預期分子量一起使用計算不同條件下蛋白質的G22值。

 
   

圖11:在pH 5的條件下,蛋白質濃度與散射強度的函數關系,以及蛋白質高濃度(80mg / mL)時的G22值。

 

結果:R90/K的強烈上升趨勢(如該蛋白質在300M NaCl制劑中的條件所示)表明凈吸引相互作用,這與在相同條件下高蛋白質濃度時計算的陽性G22值*。不含NaCl的蛋白質制劑在高蛋白質濃度時顯示出R90/K的適度增加以及負G22值,表明該蛋白質在此條件下不具有自結合的傾向。

 

 

  1. 黏度

Uncle可以比較不同蛋白質的黏度,并在制劑開發過程中更早地了解配方成分或賦形劑如何增加或降低溶液的黏度。Uncle需要的樣品量比傳統的粘度計小,因此可以用更少的蛋白質篩選更多的條件。

 

方法:對于甘油標準品,將1μL的100nm聚苯乙烯微珠和1μL的吐溫溶液分別與100μL10種不同濃度的甘油溶液(0至67%(w/w))混合。對于蛋白質樣品,以PBS為緩沖液制備濃度范圍為1-300mg/mL的BSA溶液,并將每種樣品與100nm聚苯乙烯微珠和稀釋后的吐溫混合,不含蛋白質的樣品用于標準微珠粒徑檢測。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,并在23℃進行4次數據檢測,每次5秒。對于甘油標準品,用PBS替代微珠樣品,將數據與在Rheosense microVISC上收集的黏度測量值相關聯。

 

甘油結果:使用Uncle和粘度計測定的甘油溶液黏度結果之間存在極好的相關性(圖11A),黏度高達14cP。對于每種儀器,將三次讀數取平均值以獲得圖表上的值,但是每次測量時Uncle僅需要9μL樣品,而粘度計需要400μL樣品。

 

蛋白質結果:用Uncle測量濃度高達300mg/mL的BSA溶液的黏度,黏度值高達4cP,且具有重復性(圖11B)。對于這種牛頓流體的黏度值與之前報道的通過其他方法獲得的值相符。

 

       
       
 

 

圖12:在Uncle和粘度計(A)上測量的甘油標準品黏度值的相關性,以及由Uncle(B)測量的蛋白質濃度增加時的黏度值。

 

 

小結

Uncle結合了三種檢測方法,可在單一平臺上實現更穩定的測量。通過組合各檢測方法,為研究人員提供了更大的靈活性; 例如,可以通過熱熔融和聚集跟蹤粒徑和多分散性系數。 在某些情況下,可以同時獲得兩組值(例如kD和B22)??傊?,使用一臺儀器可以完成12種不同的應用,大大降低了蛋白質樣品的體積要求,而且避免需要使用幾種單一測量儀器來確定穩定性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

       
       
 

 

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