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雙光子成像系統

更新時間:2018-08-30

簡要描述:

雙光子吸收/激發技術的原理:在強光激發下,分子同時吸收兩個光子,從基態躍遷到兩倍光子能量的激發態的過程。

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       雙光子吸收/激發技術的原理:在強光激發下,分子同時吸收兩個光子,從基態躍遷到兩倍光子能量的激發態的過程。兩個光子可以是相同波長的,也可以是不同波長的,但必須是同時吸收(兩個光子到達被激發分子的時間間隔小于1飛秒)??梢赃@樣理解,先吸收一個光子的能量躍遷到一個虛擬的中間態,然后再吸收一個光子的能量躍遷到激發態。 雙光子顯微鏡相對于共聚焦等其他顯微鏡的優點: ~ 光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發光源,這一波段的光對活體細胞和組織的光損傷小,適用于長時間的研究; ~ 穿透能力強:相對于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題;研究表明,共聚焦熒光成像的成像深度一般在50微米左右,而雙光子顯微鏡的成像深度可達1000微米; ~ 高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光,雙光子吸收僅局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內

在體可傾斜雙光子顯微成像系統 雙光子顯微成像系統的原理 雙光子顯微成像系統如何實現 • 紅外激光?秒級脈沖要求– IV級別; • 可調鈦:藍寶?光源; • ?光?到達焦點同步性; • 能量疊加在焦點激發熒光; • 光?能量?以在焦點激發?個熒光事件; • 要求必須在?個?常?的樣本區域激發染料; • ?分辨率; • 激發和發射都需要?分辨率 , 因為我們要激發?個?常?的點,我們必須保持移動的點,以激發整個樣品,這是 ?次掃描,我們使?電動旋轉反射移動這?點,?個移動的位置在X(左/右)和? 個移動位置在Y(向上/向下) 下?的圖?顯?了?個簡化的相機傳感器,每個圓圈是?個敏感的像素 當??個相機成像時,光是從樣品上的?個單獨的像素位點到達傳感器的, 傳感器同時能讀取這個像素位點的信息 但是PMT不同于相機成像,它是?個光敏感像素,并且它能分辨出光量多少 我們需要將樣品分成更多的??積區域,PMT逐?讀取每個?區域?的光信息,即我們 通常所說的像素 PMT讀取順序 • 軟件將PMT采集到的這些信息重新組建成類似于?賽克?樣的圖?,我們可以很清 晰的還原圖像。 雙光子顯微成像系統的用途 • 在較厚的?物樣品中采集到較薄的光學切?熒光圖像; • 在體雙光?熒光成像,可在活體動物組織上實現超過300微?的成像深度,觀察感興趣神經細 胞的快速3D動態變化; • 對于需要超?鏡下空間的實驗動物更有優勢,?如清醒?動物實驗平臺; • 在體可傾斜——雙光?成像物鏡可在三維平?內做任意?度的傾斜,以適應不同樣品不同成像 區域的需求; • 雙光?成像系統可為在體電?理記錄提供圖像信息,實現對特定?標神經元的紀錄; • 可以與電?理記錄、動物?為測量系統相互觸發,實現同步紀錄; 雙光子顯微成像系統的成像特點 • 在體可傾斜——雙光?成像物鏡可在三維平?內做 任意?度的傾斜,以適應不同樣品不同成像區域的 需求 • 三維深層掃描 • 掃描深度可達900微? • 只激發焦點區域,光毒性? • 信噪??,圖像清晰度? 1. 任意?度在體雙光?顯微成像系統是?套采??功率超快?秒脈沖激光器作為激 發光源、在較厚的?物樣品中采集到較薄的光學切?熒光圖像的顯微鏡設備; 2. 主要應?于在體雙光?熒光成像,可在活體動物組織上實現超過300微?的成像深 度,觀察感興趣神經細胞的快速3D動態變化; 3. 對于需要超?鏡下空間的實驗動物更有優勢,?如清醒?動物實驗平臺。雙光? 成像物鏡可在三維平?內做任意?度的在體圖像,以適應不同樣品不同成像區域 的需求。 雙光子顯微成像系統能解決的問題 購買雙光子顯微成像系統的必要性 1. 在體研究的必要性: 味覺,視覺,嗅覺,聽覺,觸覺是動物所能接受的所有外部刺激,?腦就是依靠這五種 感官的輸?來認知、學習與記憶整個外部世界的。?前來說,科研從in vitro到in vivo,多數in vivo實驗是在?醉動物上實現的,如何對freely moving animal進?研究成了科研難點。?相 對于?醉狀態下的動物來說, freely moving animal的動物才是?命真實的狀態,在freely moving animal上的實驗所得到的數據也才是可靠的數據。 購買雙光子顯微成像系統的必要性 2. ?前科研研究現狀: 我們在研究腦功能時,通常?的?法就是神經電?理的?法,?如我們想知道?腦某些特 定的區域或者特定的細胞,執?什么功能,?先要設置?個合理的任務,研究動物的?為,?如 曠場試驗,?迷宮實驗,?架迷宮實驗,同時我們會定量記錄?腦的電?理的活動,從?看?腦的 電?理活動與這個任務是如何相關的,也就是說對?腦的電?理活動與動物?為學進?相關性 分析,那我們就可以知道,動物在做某些特定?為的時候,?腦哪些細胞在放電,哪些腦區會有反 應.這是?較典型的做法。由于?前在體電?理?多數是采?盲插的?式,我們看不到細胞的 具體形態,如果與雙光?技術結合,我們就既可以看到細胞的放電活動,?可以觀察細胞在 形態學上的特征,從?更好的研究神經細胞的功能及其特點。 雙光子顯微成像系統在我平臺的應用 1. 主要應?于清醒?動物在體熒光(結構與鈣離?功能)成像,可以與本課題組??開發搭建的虛擬現實?為學 平臺相結合,實現在實驗動物的?為學習過程中,對其神經環路的功能和形態的變化進??期觀察(chronic imaging); 2. 該系統與膜?鉗系統結合,實現雙光?成像引導下的?標膜?鉗記錄(two-photon microscopy guided targeted patch-clamp recordings),可以將功能成像的群體記錄(population recordings)與單細胞閾值下的膜電位 (single-cell subthreshold membrane potential recordings)相結合,揭?神經?絡的活性是如何決定?絡中單 個神經元的表征的; 3. 該系統還配備了單細胞電穿儀(single-cell electroporator),可以在雙光?顯微成像的引導下,使?電轉導將外 源基因導?對活體動物體內的單個細胞內,通過干涉單個細胞的基因表達,并且跟蹤觀察其結構和功能的 變化,以及它對局部神經?絡的影響,研究特定細胞在?為學習、?絡調控、甚?是病程發展中的變化和作?; 4. 與學院已建?的神經分?與細胞?物學的研究平臺相結合,將進?步拓展研究?段和研究范圍,形成從分?細 胞層?,到神經環路結構功能,直?整體動物?為與功能的全?位研究體系; 實驗平臺需要滿足的條件 1.適合在體動物實驗?的固定載物臺式正置顯微鏡:電動Z軸,精度≦20nm,調焦?程≥25mm;電動XY軸,精度 ≦20nm,XY移動整體在體實驗平臺,?程≥50mm; 2. 掃描成像模式:共振掃描與檢流計掃描混合的?式。能實現512x512像素分辨率下≥28幀/秒的成像速度; 3.雙通道PMT檢測模塊。兩個通道均配置?靈敏度GaAsP PMT檢測器,檢測模塊包含IR阻擋濾鏡、紅綠發射熒光分 光濾?鏡組。為提?檢測效率,檢測器需緊靠物鏡,并且調焦時物鏡與檢測器的相對位置不變; 4.成像物鏡可在三維平?內做任意?度的傾斜,為保證成像穩定性,物鏡傾斜時需保持顯微鏡機?不移動。從物鏡到 光學平臺的?度≥30厘?,滿?在體清醒動物雙光?實驗; 5.帶有壓電陶瓷型?速物鏡Z軸掃描單元,Z軸步進?程≥400 微???膳浜?速XY掃描振鏡,實現?速三維Volume Scan; 6.進顯微鏡光路之前,激光光路中需配有普克爾盒,可實現在690 - 1020nm范圍內?速調節激光輸出功率的能?, 且可配合?速XY振鏡使?;光路中還需配有全擋光機械快?、以及功率計(實時檢測激光功率); 7. 激光器峰值功率:>425 kW at 800nm >56 kW at 690 nm >217 kW at 710 nm >217 kW at 920 nm >34 kW at 1040 nm 將要購買的雙光子顯微成像系統的優點 1. 使?共振(resonant)掃描系統具有更快的掃描速度(30幀/秒),這是傳統的振鏡(galvo)掃描系 統雙光?掃描顯微鏡掃描速度的8-10倍; 2. 更快地掃描速率使我們能?更短的間內完成所需要的重復記錄,從?縮短單次記錄(a single recording section)的時間; 3. 配備更加靈敏的光電探測器——磷砷化鎵光電倍增管(Gallium arsenide phosphide (GaAsP) PMT), 與傳統的光電倍增管(PMT)相?,對光信號的敏感度和增益提?3-6倍,能?幅提?系統的信噪?, 更重要的是讓我們能夠對光信號更弱的結構進??速成像,?如更深的?腦?層(Layer 4, Layer 5 和 Layer 6)和亞細胞結構(樹突突起和軸突的末端); 4. 配備的激光發?器系統具有更窄脈沖寬度(<70 fs)的和?散補償系統,這將?幅增強雙光?的激發 效率(excitation efficiency)。在?時間(2?時)的在體成像過程中,為了避免?強度激光造成的組織 損傷,?于成像的激光強度必須控制在較低的?平(20-40毫?); 5. 成像物鏡可在三維平?內做任意?度的傾斜,這使我們可以在保持動物頭部固定向上的姿勢的同時, 對不在?平?上的腦區成像。這對清醒動物的研究很重要,因為讓動物保持相對正常的姿勢,對于探索 正常的?為學習,有很?的影響

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